流式細(xì)胞儀在免疫表型分析、細(xì)胞周期檢測(cè)、稀有細(xì)胞鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性高度依賴校準(zhǔn)狀態(tài)。一次規(guī)范的流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)，不僅能消除儀器漂移，還能保證不同批次、不同操作人員之間的數(shù)據(jù)可比。本文以常見(jiàn)的多色檢測(cè)為例，介紹從開(kāi)機(jī)自檢到補(bǔ)償調(diào)整的完整實(shí)操流程，新手也能按步驟完成。
一、開(kāi)機(jī)與自檢?
開(kāi)機(jī)后先運(yùn)行儀器自帶的自檢程序，檢查激光功率、液流系統(tǒng)、光電倍增管(PMT)響應(yīng)及管路密封性。多數(shù)儀器會(huì)在自檢報(bào)告中給出各通道的信號(hào)強(qiáng)度與背景噪聲值，需確認(rèn)它們?cè)趶S商規(guī)定的正常范圍。若近期有移動(dòng)或維修，建議先做液流速率校準(zhǔn)，確保細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)區(qū)的速度與標(biāo)稱值一致。
二、熒光通道靈敏度校準(zhǔn)?
使用廠家配套的單色校準(zhǔn)微球(如Spherotech Rainbow Calibration Beads)，分別在各熒光通道采集信號(hào)，調(diào)整PMT電壓，使同一微球在不同通道的中位熒光強(qiáng)度(MFI)落在推薦范圍，并保證背景噪聲較低。此步驟可消除通道間的靈敏度差異，為后續(xù)多色分析打好基礎(chǔ)。
三、通道間補(bǔ)償校準(zhǔn)?
多色檢測(cè)時(shí)，不同熒光染料的發(fā)射光譜會(huì)互相重疊，必須通過(guò)補(bǔ)償消除串色。常用方法是使用單染對(duì)照樣本(只標(biāo)記一種熒光染料)，在相應(yīng)通道采集數(shù)據(jù)并生成補(bǔ)償矩陣。操作時(shí)需注意：
單染樣本濃度與染色條件應(yīng)與實(shí)驗(yàn)樣本一致；
采集足夠的事件數(shù)(一般≥5000)，保證統(tǒng)計(jì)可靠；
在軟件中輸入補(bǔ)償值或通過(guò)向?qū)ё詣?dòng)計(jì)算，保存并驗(yàn)證矩陣有效性。
四、標(biāo)準(zhǔn)微球定量校準(zhǔn)(可選)?
若需絕對(duì)計(jì)數(shù)，可使用已知濃度的校準(zhǔn)微球，在設(shè)門分析后反推細(xì)胞濃度，并據(jù)此調(diào)整流速或軟件換算系數(shù)，確保定量結(jié)果準(zhǔn)確。
五、記錄與復(fù)校?
將校準(zhǔn)日期、環(huán)境條件、微球批號(hào)、PMT電壓、補(bǔ)償矩陣等參數(shù)完整記錄。建議每1–3個(gè)月或在更換激光器濾片、維修液路后重新校準(zhǔn)，遇到數(shù)據(jù)異常(如分群偏移、背景升高)應(yīng)及時(shí)排查并復(fù)校。
從開(kāi)機(jī)自檢到補(bǔ)償調(diào)整，流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)并不復(fù)雜，關(guān)鍵在于按規(guī)程操作并堅(jiān)持記錄。規(guī)范的校準(zhǔn)能讓儀器始終保持較佳狀態(tài)，為免疫學(xué)研究與臨床診斷提供穩(wěn)定、可靠的數(shù)據(jù)支撐。
更新時(shí)間：2025-12-22
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